Referat INGINERIA METABOLICA LA DROJDII

label Referate autorenew 2025-09-29, 16:56 history_edu virgil
Ingineria metabolic la drojdii Saccharomyces cerevisiae este cel mai intens studiat microorganism eucariot, care ajut la cunoaterea biologiei celulei eucariote i, implicit, a biologiei umane. Vreme de cteva secole Saccharomyces cerevisiae a fost ntrebuinat n producerea de alimente i buturi alcoolice, iar azi acest microorganism este folosit n numeroase procese din cadrul industriei farmaceutice. Saccharomyces cerevisiae este un organism cu care se lucreaz uor, deoarece este nepatogen, i datorit multitudinii de aplicaii aprute de-a lungul timpului n obinerea de produse consumabile, ca etanolul sau drojdia, a fost clasificat ca organism GRAS (generally regarded as seif = organism considerat sigur, netoxic). De asemenea, fermentaia i procesele tehnologice de producie la scar larg cu Saccharomyces cerevisiae fac ca acest organism sa fie atractiv, la ndemn, pentru cteva scopuri biotehnologice, aa cum va fi ilustrat n continuare. Un alt motiv important pentru a justifica utilizarea microorganismului Saccharomyces cerevisiae n cadrul biotehnologiei l reprezint susceptibilitile sale la modificrile genetice prin tehnologia ADN recombinant, care a fost mai departe nlesnite de accesul la secvena genomic complet a Saccharomyces cerevisiae, publicat n 1996 [1] . mbuntirea tulpinilor de drojdie de bere s-a bazat n mod tradiional prin mutagenez la ntmplare i pe ncrucirile genetice a dou tulpini, urmate de screening, n funcie de calitile de interes ale mutantelor. Dezvoltrile recente ale unor metode sofisticate n domeniul tehnologiei ADN recombinant au permis s se manipuleze o anumit cale de interes i de aici s se mbunteasc celula printr-o abordare mai direct. Totui, acum este posibil s se introduc anumite perturbri genetice n sensul de a modifica puterea de iniiere a unei anumite gene, de a induce deleii asupra genelor sau de a introduce gene ntregi n celul [2] . mbuntirile propietilor celulare obinute prin combinarea analizelor teoretice bazate pe informaiile de biochimie i pe aplicaiile ingineriei genetice, au fost oferite de ingineria metabolic [3]. Aceast abordare const n mare n dou aspecte importante:1.partea analitic a ingineriei metabolice, care se ocup cu studiul celulelor pentru identificarea tintelor cele mai potrivite i2.ingineria genetic a celulelor care se ocup de obinerea unor celule cu modificrile genetice dorite.Un mod de a grupa diversele inte pentru ingineria metabolic ar cuprinde:- extensia categoriei substratului;- mbuntiri ale productivitii i produciei (profitului);- mbuntirea performanei procesului biotehnologic;- mbuntirea propietilor celulare.1.5.1. Noi concepte asupra ingineriei metabolice Dup cum s-a menionat i n introducere, ingineria metabolic implic o abordare direct asupra aplicaiei tehnologiei ADN recombinant pentru mbuntirea tulpinilor, i a fost definit ca ?mbuntirea direct a formrii produsului sau a propietilor celulare prin modificarea unor reacii biochimice specifice sau introducerea altora noi cu folosirea tehnologiei ADN recombinant? [4]. n acest definiie termenul ?reacii biochimice? trebuie interpretat n sensul lui mai larg. Ceea ce distinge ingineria metabolic de aplicaiile clasice de biologie molecular este folosirea unei abordri directe. Aceasta presupune cunotine bogate despre sistemul folosit i, dup cum a fost menionat n introducere, ingineria metabolic conine dou pri: partea analitic i partea sintetic. Aceast situaie este ilustrat n Figura 4. n anumite cazuri partea sintetic o precede pe cea analitic, dac natura substratului are nevoie de o extindere prin expresia unei enzime heterogene, dar n toate cazurile este important ca prile analitic i sintetic s mearg mn n mn.Acest lucru este foarte bine ilustrat prin ncercrile de a extinde natura substratului. Aici, n mod clar, primii pai sunt de a introduce gene heteroloage care activeaz metabolismul substratului de interes, iar n acest scop este important s lum n consideraie dou strategii diferite:a.introducerea unei gene ce codific o protein de legtur a membranei, care transport un anumit substrat n celul n combinaie cu o gen ce codific o protein responsabil pentru scindarea substratului;b.introducerea unei gene ce codific o protein secretat n mediul extracelular, unde substratul de interes este transformat sau scindat n substraturi care ar putea fi asimilate direct de organismul gazd. Figura 4. Aspecte variate ale ingineriei metabolice mprite n partea analitic i partea sintetic.Indiferent de strategia aleas, este important s se asigure c genele heterogene sunt exprimate suficient n noul sistem gazd. Aceasta poate implica luarea n considerare a unor posibile modificri postranslaionale, care pot diminua sau elimina activitatea enzimei de interes, iar aceasta necesit analize atente ale tulpinii recombinante. Dup obinerea unui organism recombinant ce poate folosi un anumit substrat, deseori se obin rate sczute i producii n general mici ale produsului din substratul respectiv. Pentru a identifica problema cea mai important i a direciona urmtorul pas sintetic este necesar s se detvolte o analiz detaliat a fiziologiei celulei. Aceasta poate fi ilustrat n mod clar n ncercarea de a transforma xiloza la etanol prin fermentaii anaerobe cu Saccharomyces cerevisiae. Astfel, ingineria metabolic aproape ntotdeauna va implica o strns interaciune ntre prile analitic i sintetic, de obicei fiind necesare mai multe tipuri de construcii de tulpini, nainte de obinerea unei tulpini recombinante optime. n ingineria metabolic la Saccharomyces cerevisiae, partea sintetic este relativ devansat de partea analitic. Aceasta se datoreaz complexitii metabolismului celular, ce poate interaciona cu exprimarea genelor, ce poate determina niveluri metabolice prin concentraia de enzime. n multe cazuri sunt necesare multiple modificri, iar pentru fiecare modificare, pot aprea schimbri neateptate ale metabolismului celular. Partea analitic se refer n mod clasic la fiziologie, n ultimii ani numeroase tehnici avansate fiind utilizate pentru o analiz mult mai elaborat a fiziologiei celulare. Aceasta include tehnici ale ADN pentru analiza transcriptoamelor (cuantificarea simultan a tuturor genelor transcrise ntr-o celul), gel bidimensional de electroforez pentru analiza proteoamelor (cuantificarea simultan a unui numr mare de proteine ntr-o celul), gaz cromatografie cu sprectrometria de mas (GC ? MS) i lichid cromatografie cu spectrometrie de mas (LC ? MS), pentru analiza nivelurilor metabolice intracelulare, experimente cu C13 pentru analiza reelei metabolice, studii avansate de fermentaie cu monitorizare on ? line a variabilelor de cultivare mai importante i bioinformatica (modele matematice pentru analiza structurii cilor i structurii fluxurilor).1.5.1.1. Analiza transcriptoamelor i proteoamelor Analiza metodologiei ADN n domeniul transcriptoamelor este o tehnic nc nou n prezent nefiind exemple despre modul cum a fost folosit tehnica n ramurile ingineriei metabolice. Deoarece multe provocri n ingineria metabolic implic schimbri genetice multiple, analiza transcriptoamelor va fi foarte important pentru ingineria metabolic n viitor, deoarece aceast analiz permite studierea schemei exprimrii multor gene. Ca i analiza transcriptoamelor, analiza proteoamelor este important n ingineria metabolic. Deseori cile de activitate sunt corelate direct cu concentraia proteinelor, i cnd exprimarea genelor i/sau interaciunile protein ? protein sunt supuse unei regularizri metabolice, este important s se cuantifice concentraia proteinelor n diferite tulpini recombinante. n mod clar, o analiz detaliat a proteomului poate fi valoroas, deseori fiind suficient stabilirea concentraiei de proteine implicate n cile studiate i uneori msurarea unor proteine reglatorii ce afecteaz exprimarea genelor relevante.1.5.1.2.Cile de analiz Cile de analiz sunt folosite deseori pentru a descrie aplicaia analizei fluxului metabolic (MFA) i analiza controlului metabolic. Cile de analiz s-au dovedit a fi un succes, ca instrument ajuttor pentru partea analitic a ingineriei metabolice. MFA este o abordare global a celulei, unde se ia n calcul reeaua complet a reaciilor intracelulare, unde sunt cuantificate fluxurile, prin ramurile individuale ale reelei. Fluxurile metabolice pot fi estimate din balanele i msurtorile de metabolii ale ctorva ci, prin introducerea substraturilor marcate cu C13, urmate de msurtorile distribuiei acestora n metaboliii intracelulari. n acest caz spectroscopia de rezonan magnetic nuclear sau GC ? MS poate fi folosit pentru a msura tiparul metaboliilor precursori marcai. Aplicarea de substraturi marcate permite determinri de flux ale reaciilor reversibile i cuantificarea raiilor de flux ntre cile biosintetice ce duc la acelai metabolit. Compararea distribuiilor fluxului obinute n diferite condiii fiziologice poate da informaii de pre despre interaciile dintre diferite ci sau poate ajuta la identificarea unor posibile reacii biochimice, care nu au fost descoperite n prealabil ntr-un anumit microorganism [5] . Totui, MFA poate fi folosit n alegerea unei strategii bune pentru ingineria metabolic, dar, poate fi folosit i ca un instrument pentru caracterizarea fiziologic a unei tulpini, ce a fost manipulat n vederea introducerii unei propieti noi sau modificate. Un domeniu n care MFA este interesat este mbuntirea productivitii. Acest lucru este ilustrat n Figura 2, n care se prezint o cale foarte simpl, n care substratul A este convertit n produsul B, cu formarea produsului C. Substratul A poate fi glucoza, produsul B poate fi etanolul i produsul C poate fi glicerolul. Depirea obinerii produsului de substrat este determinat de raia fluxurilor JB i JA, unde productivitatea este dat de fluxul JB. Intermediarul I nu se poate acumula n interiorul celulei, fluxul acestui metabolit va fi egal cu fluxul ce iese din polul metabolitului. (Figura 5). Fluxurile sunt descrise de ecuaia: JA = JB + JC, unul din aceti termeni poate fi calculat, dac celelalte dou sunt msurate. Acesta este conceptul balanei metaboliilor. O strategie clar pentru a mbunti obinerea total de JB este de a reduce sau de a elimina fluxul JC i astfel n mod direct va ajunge mai mult carbon la produsul JB. Oricum, formarea lui C joac de obicei un rol important n metabolismul celular, iar eliminarea JC de o deleie a unei gene, va fi letal pentru celul sau va conduce spre auxotrofie. n unele cazuri fluxurile pot fi determinate de constrngeri adiionale, dac anumii cofactori ca NAD(P)H sunt implicai n diferite ramuri. Modularea distribuiei fluxului n jurul punctului metabolic I, cere bineneles analiza complet a reelei metabolice i de aceea conceptul de MFA este foarte important. MFA este n general cel mai folositor n cazurile n care o fraciune relativ mrit a lui C este direcionat spre produs n vederea obinerii de metabolii primari. Nu n ultimul rnd, conceptul de MFA poate, de asemenea, s contribuie la nelegerea modului n care producerea de metabolii secundari sau proteine heteroloage este legat de metabolismul central al lui C, prin canalul metaboliilor precursori.[6] MFA, de asemenea joac un rol important n clasificarea ramurilor metabolice. Prin analiza diferitelor mutante este posibil obinerea de informaii despre reglarea diferitelor fluxuri, dac o anumit locaie a cii metabolice este flexibil sau nu. Pentru o locaie metabolic rigid, enzimele din jurul punctului metabolic I din Figura 6 pot fi reglate prin regularizarea alosteric. Astfel, implicarea activitii uneia dintre enzime, n cascada de reacii dintre intermediarul I spre produsul B, ar putea s se rezolve printr-o cretere a fluxului JB i implicit a randamentului n produs. Figura 5. Fluxul metabolic JA, JB i JC prin intermediul I care este un precursor al metaboliilor B i C.Aceasta sugereaz un alt aspect important al cilor de analiz, i anume identificarea enzimei, care exercit controlul fluxului ntr-o cale metabolic dat. De fapt, problema cu locul de intire al genomului, pentru a obine o cretere a fluxului printr-o anume cale, este legat de toate categoriile de inginerie metabolic menionate n introducere. Figura 6. Cile metabolice ale glucozei i xilulozei. Analiza controlului fluxului este o examinare a bazelor celulare ?locale? ce deseori sunt implicate ntr-o singur cale metabolic, n contrast cu MFA, unde se considera ntreg metabolismul celular. Studierea controlului fluxului determin efectele perturbrilor n activitile enzimatice, pentru a identifica cea mai bun int enzimatic pentru manipularea genetic. Interesul general este de a supraexprima genele specifice de codificare a enzimelor, care exercit cel mai mare control asupra fluxului dintr-o cale, deoarece supraexprimarea unei ci ntregi poate fi foarte laborioas i deseori imposibil. Pentru examinarea controlului fluxului printr-o anume cale metabolic, cadrul analizelor de control metabolic poate servi ca o unealt folositoare. Exist o varietate de metode pentru determinarea aa ? numiilor ?coeficieni de control al fluxului?, care determin un flux relativ mrit datorit unei oarecare creteri a activitii enzimelor individuale [7]. La dezvoltarea analizei cilor metabolice este, de asemenea important s se determine intermediarii ce ar lua parte ntr-un anumit mecanism metabolic, care ar putea fi toxici pentru celul n anumite condiii. n plus, este important s tim dac o anumit cale intermediar este implicat ntr-o cale de transducie ? semnal, care regularizeaz fluxul prin calea metabolic de interes, prin anumite interaciuni specifice protein ? protein sau prin influen la nivel transcripional [8] . Cea mai bun strategie utilizat n studiile de inginerie metabolic la Saccharomyces cerevisiae pentru consumul de xiloz a fost introducerea genelor XYL1 i XYL2 originale din drojdii capabile s utilizeze xiloza (Candida shehatae, Pichia stipitis). Gena XYL1 codific xiloz-reductaza (XR) care reduce xiloza la xilitol cu consum de NAD(P)H. Conversia xilitolului n xiluloz este obinut de gena XYL2 care codific xilitol-dehidrogenaza (XDH) (Figura 6).1.5.2. Creterea productivitii i produciei Aspectele variate ale ingineriei genetice asupra drojdiei de bere au fost revizuite acum civa ani. Este posibil s fie introduse propieti noi n drojdia de bere, printr-o puternic conexiune ntre calea analitic a ingineriei metabolice i manipularea genetic a celulei, pentru a ajuta ca procesul s fie mai profitabil. Unul dintre principalele motive pentru cererea unei lungi perioade de folosire a berii este conversia nonenzimatic i nceat a ? - acetolactatului, la componentul nedorit i fr arom ? diacetilul, care este convertit enzimatic la aceton i subsecvenial la 2, 3 butan ? diol. O cale de a evita pierderea aromei, cauzat de diacetil, este introducerea unei metode alternative de dereglare a ? - acetolactatului, pentru a se trece peste formarea acetilului. Totui, modificrile genetice asupra drojdiei de bere prin introducerea ? - acetolactat decarboxilazei heterogen, determin tulpinile transformate s produc acetona direct din ? - acetolactat, ceea ce accelereaz procesul de cretere prin diminuarea fazei de lag de la sptmni la ore (Figura 7). ? - Acetolactat decarboxilaza a fost evideniat cu succes n drojdii i provine de la Klebsiella terrigena, Enterobacter aerogenes i Acetobacter xilinum.[9] Alte ncercri de a minimaliza formarea de diacetil n drojdiile de bere au fost ncununate de succes, prin screening pentru anumite mutante i supraexprimarea unor gene specifice, care codific enzime implicate n procesul de biosintez a valinei. Figura 7. Cile biochimice ce conduc la glicerol, piruvat i etanol. Prin tehnicile de screening pentru mutante rezistente la erbicidul sulfometuron metil i expunerea gradat n mediu deficient n valin i izoleucin (izoleucin- i valin-), s-au descoperit tulpini cu activitate de sintez a acetolactatului sczut, ce determin un flux de carbon sczut, direcionat spre formarea de ? - acetolactat. Numai jumtate din cantitatea de diacetil a fost produs de unele din acele tulpini n comparaie cu tulpinile parentale. O alt strategie de succes a fost cea de cretere a fluxului, prin calea biosintetic a valinei, n scopul de a trece peste formarea diacetilului. Manipularea cii metabolice centrale la Saccharomyces cerevisiae a fost folosit pentru a se crete productivitatea de etanol. Cnd 8 enzime diferite ale glicolizei au fost exprimate separat n multivectori, nici una dintre tulpinile transformate nu a determinat o producere mai mare de etanol dect tulpina de tip slbatic. Nici chiar supraexprimarea enzimelor ce catalizeaz reaciile ireversibile, ca hexochinaza, fosfofructochinaza i piruvatchinaza, nu au avut efect asupra producerii de alcool. Aceste rezultate ilustreaz rigiditatea controlului fluxului prin metabolismul central al Saccharomyces cerevisiae. Oricum, alte studii au raportat c folosirea fosfofructazei a mbuntit productivitatea de etanol n cazul resturilor celulare imobilizate care cresc doar aerob. O problem major n legtur cu producerea de etanol prin fermentaia anaerob la Saccharomyces cerevisiae este formarea substanial de glicerol, ca produs secundar. n condiiile de cretere aerob, NADH citosolic format din biomasa poate fi reconvertit la NAD+ prin formarea de glicerol, n concordan cu dehidrogenazele NADH mitocondrial extern, codificate de genele NDE1 i NDE2 i alternativ printr-un sistem necunoscut. Anaerob, oxidarea NADH citosolic se poate produce doar prin formarea de glicerol, deoarece fosforilarea oxidativ nu funcioneaz n astfel de condiii. Exist dou gene, GPD1 i GPD2, amndou codificnd glicerol - 3 - fosfat dehidrogenaza, care regenereaz NAD+din NADH, n timp ce convertete dihidroxiaceton ? fosfatul la glicerol - 3 - fosfat, dar izoenzima codificat de gena GPD2 s-a demonstrat ca fiind cea mai important dintre cele dou, n condiii de anaerobioz. Conversia total a glucozei la etanol este redox neutr, deoarece NADH este format de gliceraldehida - 3 - fosfat -dehidrogenaza i deoarece conversia acetaldehidei la etanol include regenerarea NAD- din NADH (Figura 7) de ctre alcool dehidrogenaza I (codificat de ADH1) [10]. Astfel, formarea glicerolului este important pentru meninerea echilibrului redox din citosol, pentru a reoxida NADH format. O posibil strategie pentru a optimiza producia de etanol poate fi deducerea formrii glicerolului, prin redirecionarea fluxului de carbon, prin manipularea metabolismului redox. Cnd o mutant gpd2 a fost crescut n condiii de anaerobioz a fost obinut o producie mai mare de etanol cu 8% n concordan cu reducerea de 40% a formrii glicerolului, dar creterea specific maxim a fost redus cu 45% n comparaie cu tulpina de tip slbatic, W303 ? 1A [11]. Rezultate similare au fost obinute cu o mutant gpd2, provenit de la alt tulpin de tip slbatic, unde producia de etanol a fost mrit doar cu 4,75 fiind observat o reducere a maximului specific de cretere. Cum o tulpin mutant cu o dubl deleie gpd1 i gpd2 este incapabil de a crete n condiii de anaerobioz, introducerea unei noi ci pentru a regenera NAD+- a fost realizat prin exprimarea unei transhidrogenaze bacteriene (ce catalizeaz NADH + NADP + NAD+ + NADPH), provenite de la Azotobacter vinelandii, ntr-o mutant dubl gpd1gpd2. Din nefericire, unirea NAD+ a devenit limitatoare pentru sinteza biomasei, nainte ca transhidrogenaza s fie capabil de a susine sinteza de NAD+, observndu-se de asemenea i lipsa creterii n condiii de anaerobioz. Figura 8. Asimilarea NH4+ n Saccharomyces cerevisiae, unde 2 - oxoglutaratul i NH4+ sunt transformate n glutamat prin dou ci diferite. ntr-o alt abordare asupra implicrii ingineriei metabolice n mrirea produciei de etanol la Saccharomyces cerevisiae s-a intervenit n metabolismul energetic care a fost condus n sensul schimbrii cerinelor cofactorilor, n asociaie cu asimilarea de amoniac. Asimilarea de amoniac la Saccharomyces cerevisiae este descris n Figura 8. Amoniacul i 2 ? oxoglutaratul pot fi convertii n glutamat, de diferite izoenzime ale glutamat dehidrogenazei, folosind NADPH (Gdh1) sau NADH(Gdh2) drept cofactori [12]. Amoniacul poate fi asimilat i de glutamin ? sintetaza (Glu1), cu formarea de glutamin, care este convertit n glutamat prin aciunea glutamat ? sintetazei (Glt1); suma celor dou reacii ale Glu1 i Glt1 este artat n Figura 5. Aceste dou reacii cuplate folosesc NADH i ATP i au un nivel crescut dac formarea de glutamat apare doar pe aceast cale. Strategia este de a reduce surplusul de NADH format n asociaie cu sinteza biomasei n combinaie cu producerea unei creteri de consum de ATP, care ar reduce cerinele referitoare la producerea de glicerol i ar crete formarea de etanol. Deleia genei GDIII va da o cretere a produciei de etanol cu 8% i o descretere a produciei de glicerol, dar maximul ratei specifice de cretere a fost pe jumtate ? n comparaie cu cel al unei tulpini de tip slbatic, datorit unei reduceri a ratei de sintez a glutamatului. Prin deleia genei GDIII i supraexprimarea genelor GLN1 i GLT1 de ctre promotorii PGK, producia de etanol a fost mrit cu 3%, n comparaie cu tulpina gdh1, supraexprimarea acestor dou gene reducnd maximul ratei specifice de cretere la 90% fa de tipul slbatic. Cnd GDH2 a fost supraexprimat de un promotor, ntr-o tulpin mutant GDH, maximul ratei specifice de cretere a fost n principal egal cu cel al unei tulpini de tip slbatic. Oricum scderea observat n formaiunile de glicerol a rezultat nu dintr-o cretere considerabil a produciei de etanol, ci, mai degrab dintr-o cretere a producerii de biomas. Totui ingineria metabolic care diminueaz formarea de glicerol prin solicitarea unei cantiti mrite de NADH reoxidat n celul, nu conduce neaprat la o mrire a produciei de etanol. Pentru a servi acestui scop, o reducere a surplusului de NADH ar trebui combinat cu un consum mai mare de ATP n formarea biomasei, unde celula compenseaz pentru cererea energetic mrit, prin creterea fluxului spre etanol. Acest exemplu ilustreaz cum un flux mbuntit pe una din ci poate fi obinut prin ingineria unei ci complet diferite i arat c este important ca ntreaga reea metabolic s fie luat n consideraie. n completarea exemplului mai sus amintit, mrirea ratei de conversie a ATP la ADP poate fi obinut prin introducerea activitii unei ATP-aze unei anumite celule, unde producia unui anumit component poate fi mbuntit. Recent, au fost descrise numeroase aplicaii ale acestei abordri [13] . n contrast cu drojdiile folosite n industria buturilor alcoolice, este de dorit s direcionm fluxul de carbon spre glicerol n timpul formrii de etanol la drojdiile productoare de vin, deoarece glicerolul poate mbuntii calitatea vinului, oferindu-i consisten.1.5.3. Imbuntirea performanelor procesului Pentru a mbunti producia la nivelul produilor biotehnologici, este foarte important s se utilizeze disciplinele de inginerie genetic, care se ocup de designul bioreactorului i optimizarea tehnologiilor fermentative, care poate duce la o mbuntire a performanelor procesului biotehnologic, obinndu-se supraproducii. Problematica dezvoltrii unor metode optime, pentru mbuntirea anumitor operaii ale procesului tehnic este legat de capacitatea tulpinilor de Saccharomyces cerevisiae de mbuntii performanele procesului. Saccharomyces cerevisiae care poate suferi o cretere pseudohifal, poate forma asociaii floculare, proprietate ce este de obicei atribuit drojdiilor de fermentaie [14]. O tulpin de drojdie de bere potrivit ar trebui s fie n stare de a produce floculare, deoarece aceast proprietate este cea mai convenabil de a limpezi berea n comparaie cu celelalte metode convenionale, cum ar fi filtrarea i centrifugarea [15] . Numeroase studii privind flocularea au generat o baz mare de date, dar din nefericire, compararea acestor date este restricionat, datorit diferenelor privitoare la condiiile de testare i de cretere. Dou mecanisme de floculare complet diferite au fost observate pn acum: fenotipul NewFlo, gsit n numeroase tulpini de drojdii de bere, i fenotipul Flo1, gsit n cele mai multe tulpini floculare de laborator.Cele dou fenotipuri difer remarcabil chiar prin felul de a flocula. Fenotipul Flo1 d natere la floculaie n timpul creterii, neinnd seama de semnalele pe care le primete din mediu, cum ar fi limitarea nutrienilor, n timp ce flocularea fenotipului NewFlo se pare a fi lansat la sfritul creterii exponeniale, cnd i face apariia lipsa de glucoz. Ultima apariie a floculrii la fenotipul NewFlo este un avantaj evident pentru industria buturilor, ajutnd la separarea drojdiilor de butur, dar genetica fenotipului NewFlo rmne a fi descoperit. Totui o continuare a muncii este necesar pentru a da o imagine complet asupra genelor implicate n fenotipul Flo1, deoarece sunt necesare mai multe cunotiine genetice, dect pentru fenotipul NewFlo. Fenotipul Flo1, conine una sau mai multe din genele dominante floculare, din care a fost studiat gena FLO1. Aceasta codific o protein a suprafeei celulare, care joac rolul principal n procesul de floculare. Proteina Flo1 este ancorat n peretele celular unde partea N- terminal este expus mediului, iar n timpul floculrii acest fragment N-terminal se poate ataa de manoproteinele din peretele celular vecin. Gena FLO1 a fost integrat cu succes n genomul unei tulpini de drojdie de bere monoflocular, obinndu-se o tulpin flocular stabil. Flocularea prin fermentare cauzeaz o micorare a numrului de celule, mrind timpul general de fermentaie. Gena FLO1 din tulpinile cu fenotipul Flo1, pare a fi legat la nivel transcripional de o cretere n transcrierea FLO1, corelat cu o cretere a floculrii. Flocularea constitutiv a fost observat n toate stadiile de cretere, dar a fost intensificat n fazele de declin i n faza staionar a creterii. Pentru a introduce flocularea ntr-o gazd nefloculant ar fi necesar s se stabileasc un sistem genetic care s exprime gena pentru floculare doar spre sfritul fermentaiei. Astfel, ingineria metabolic ar trebui s se concentreze pentru a determina un anumit sistem genetic, care conine una sau mai multe gene floculare dominante. Subiectul mecanismului de control care este responsabil pentru apariia floculrii la limitarea nutrienilor la tulpinile fenotipului NewFlo este nc necunoscut [[16], [17]]. Dei, introducerea floculrii la drojdiile de bere este o metod convenabil de separare a drojdiei din mediu se utilizeaz nc filtrarea berii care este o etap tehnic important n industria de buturi. Prezena - glucanilor n orz, mpiedic filtrarea datorit vscozitii mrite, (Saccharomyces cerevisiae nu poate hidroliza legturile 1,4 ale - glucanilor) i de aceea este necesar adugarea unor enzime comerciale. Alternativ, poate fi introdus in drojdia de bere o gen heteroloag care codific - gluconaza de Bacillus subtilis i Trichoderma yeesei. Ultima opiune servete ca sarcina pentru ingineria metabolic, deoarece substratul este mrit pentru a include i - glucanul i n consecin procesul de obinere a berii poate fi mbuntit. [18]1.5.4. mbuntirea propietilor celulare Un efort mrit s-a depus pentru a mbunti propietile existente ale Saccharomyces cerevisiae, legate de exploatarea industrial a acestui organism. Interesante n acest sens sunt cercetrile legate de a obine o reducere a represiei glucozei, folosit n consumul de sucroz i maltoz, care sunt prezente n amestecurile de zahr din industrie i care sunt metabolizate n mod natural de Saccharomyces cerevisiae. Drojdia de bere este produs aerobic din melase, care conin 40% pn la 50% sucroz. Producia de etanol i produsele de panificaie sunt procese anaerobe folosite la scar larg, unde Saccharomyces cerevisiae metabolizeaz amestecurile de zahr. Malul folosit pentru producerea de etanol conine 50 ? 60% maltoz, iar amidonul prezent n aluatul pentru pine este continuu descompus n oligozaharide prin aciunea amilazelor [31] Saccharomyces cerevisiae hidrolizeaz extracelular sucroza i intracelular maltoza prin aciunea invertazei (Suc2) i respectiv maltazei (MalS) (Figura 9). Transportorul maltozei (MalT) joac un rol esenial n exprimarea genelor MAL, deoarece maltoza este cerut ca un inductor al acestor gene, n contrast cu exprimarea genei SUC2, care nu are nevoie de inducere. Gena MAL cuprinde, de asemenea, gena MALR, care codific o protein reglatoare responsabil pentru inducerea genelor MALT i MALS. Figura 9. Metabolismul sucrozei i maltozei, n concordan cu genele respective: Suc2 invertaza, MalT permeaza, MalS maltaza, MalR responsabil de reglarea proteinelor pentru inducerea genei MalS i MalT. Cnd maltoza sau sucroza sunt prezente n mediu mpreun cu glucoza, fazele de lag intermitente sunt situate ntre consumul glucozei i consumul iniial de sucroz sau maltoz, fenomen descris ca fiind sub controlul glucozei. Acest mecanism reglator poate avea un efect costisitor asupra proceselor menionate mai sus, datorit timpului destinat procesului de control al glucozei. Sistemul reglator care asigur consumarea glucozei naintea altor zaharuri a fost studiat mai ales la nivel transcripional, la nivelul represiei glucozei. Represia glucozei, nlesnit de proteina Mig1, controleaz exprimarea ambelor gene SUC2 i MAL. Mecanismul molecular al represiei glucozei cu ajutorul Mig1, este o cascad reglatorie care poate implica un complex de proteine ce conine Ssn6, Tup1 i Mig1, unde Mig1 dirijeaz complexul spre un consens specific, spre promotorii genelor int. Genele int ale Mig1 sunt limitate nu numai de genele ce codific proteinele implicate n funciile periferice ale celulei, cum ar fi gena SUC2, gena MAL i gena GAL (ce codific proteinele responsabile de utilizarea galactozei) i de genele metabolismului central al carbonului [[19], [20]]. Pentru a depi represia glucozei exercitat de gena SUC2, deleia MIG1 ntr-o tulpin de laborator haploid (W303 ? 1a) s-a dovedit a fi un succes, deoarece s-a observat o cretere a exprimrii genei SUC2, ce a fost obinut atunci cnd celulele au crescut pe glucoz. n plus, micorarea controlului de glucoz a fost observat la creterea a 2 mutante mig1 derivate dintr-o alt tulpin de laborator haploid i o tulpin poliploid industrial, respectiv pe amestecurile sucroz ? glucoz. O alt protein recent descoperit, Mig2, contribuie de asemenea la controlarea exprimrii genei SUC2. Deleia adiional a MIG2 ntr-o tulpin mutant mig1 a artat o depreciere continu a exprimrii genei SUC2. Studiile fiziologice ale deleiilor tulpinilor mig1mig2 au indicat c frmiarea lui MIG2 a condus la o continuare a micorrii controlului glucozei i o mrire a activitii respiratorii; mai mult, s-a obinut o cretere de 12% a ratei specifice de cretere pe glucoz n comparaie cu tipul slbatic. Prin urmare, deleia concomitent a lui MIG1 i MIG2 s-a dovedit a fi un succes n producia drojdiilor de panificaie, deoarece controlul glucozei este micorat cu succes n metabolismul sucrozei [21]. Rata de consumare a glucozei folosit n procesul industrial poate fi mrit fr a aprea efectul Crabtree, iar rata specific de cretere, care servete ca un important parametru n producia drojdiilor de panificaie, este mrit prin aceast abordare. Strategiile de succes pentru metabolismul energetic al genelor MAL pentru diminuarea extinderii controlului glucozei exercitat asupra acestor gene este diferit de strategiile mai sus amintite. Transferul genei MIG1 n tulpina haploid de tip slbatic B224 a micorat ncet controlul glucozei exercitat asupra genelor MAL. Oricum, acest efect nu s-ar fi putut obine cu mutante mig1 derivate din haploida CEN. PK113 ? 7D i tulpina poliploid industrial DG1342.[22] Tulpinile mutante mig1 derivate din ultimele dou tulpini de tip slbatic au nceput s consume maltoza la niveluri mai sczute de glucoz, cnd au fost cultivate n medii complexe cu glucoz ? maltoz, n comparaie cu tipurile parentale. S-a concluzionat c aceasta se datoreaz unei inactivri mai puternice a metaboliilor permeazei maltozei. Scindri adiionale ale genei MIG2 n mutante derivate din tipul slbatic CEN. PK113 ? 7D au artat un fenotip uor mai represat dect mutanta mig1. Desfacerea lui MIG1 (i MIG2) poate derepresa anumite proteine implicate n semnalizarea glucozei, iar aceste proteine mediaz inactivarea permeazei maltozei. Mai multe raporturi arat c inactivarea catabolic a permeazei maltozei, are un impact major asupra metabolismului maltozei, iar analizele de control metabolic indic de asemenea, c permeazele maltozei limiteaz metabolismul maltozei [23]. n loc de a inti gene reglatoare ca MIG1 i MIG2, mbuntirea consumului de maltoz din amestecurile glucoz ? maltoz au fost obinute prin exprimarea constitutiv a genelor structurale MAL. Exprimarea constitutiv a MALT i MALS n mutanta mig1 derivat din tipul slbatic B224, a artat o utilizare simultan a glucozei i maltozei. Cnd MALT i MALS au fost supraexprimate n tulpina de tip slbatic, maltoza a fost utilizat n defavoarea glucozei. Dup ct se poate presupune, supraexprimarea genei MALT contracareaz complet efectul de inactivare a catabolismului carbonului n transportorul maltozei. n sprijinul micorrii controlului glucozei, supraexprimarea celor dou gene strcturale MAL a crescut rata specific de cretere cu 0,03h-1 i la glucoz i la maltoz, comparativ cu cea a tipului slbatic [24]. Deci, aceast strategie pare s fie atractiv pentru micorarea controlului glucozei n metabolismul maltozei n cazul drojdiilor de fermentaie, ceea ce reduce timpul de producere a etanolului. Controlul redus al glucozei arat, de asemenea, un timp redus al procesului de producere a pinii, care este mai departe micorat deoarece aluatul poate crete i mai repede, ca rezultat al mririi ratei specifice de cretere. Deleia genelor ce codific proteinele represoare de transcripie sau supraexprimarea genelor ce codific activatorii transcripionali pozitivi, poate fi o strategie de succes pentru ingineria metabolic, n anumite sisteme metabolice. Aceast strategie poate rezulta din supraexprimarea mai multor gene, care sunt subiectul controlului transcripional implicnd proteina represoare de deleie sau proteina represoare. n anumite cazuri aceast abordare va fi favorabil n comparaie cu supraexprimarea genelor ce codific unele sau toate enzimele unei anumite ci metabolice [25].1.6. Producerea de proteine heteroloage De-a lungul studiilor efectuate asupra comportamentului Saccharomyces cerevisiae, ca i a importantei capacitii acestei drojdii de a exprima gene strine n combinaie cu aparatul ei secretor, face din Saccharomyces cerevisiae un organism-gazd atractiv pentru producerea de anumite proteine heterogene. Numeroase proteine heterogene care au fost folosite n scopul de a diagnostica sau ca ageni terapeutici umani i vaccinuri au fost produse cu succes de Saccharomyces cerevisiae. Interferonul uman a fost prima protein recombinant produs de Saccharomyces cerevisiae n 1981, iar n anul urmtor a fost produs primul vaccin obinut prin intermediul ingineriei genetice [26]. Producia industrial de insulin de ctre Saccharomyces cerevisiae, acoper aproape jumtate din nevoia de insulin a 154 de milioane de diabetici din ntrega lume [27]. n ultimii ani secreia de insulin a Saccharomyces cerevisiae a fost mbuntit prin ingineria proteinelor secvenei leader, iar de mbuntirile realizate va beneficia nu numai farmaciile i diabeticii, ci i potenialul de organism-gazd al Saccharomyces cerevisiae pentru producerea, de alte proteine heterogene. Saccharomyces cerevisiae are o cale secretorie multipl i este capabil de a produce modificri posttranslaionale ale proteinelor heterogene, cum ar fi maturarea proteolitic a prohormonilor i formarea legturilor bisulfidice.[28]Aceste trsturi se aseamn cu cele ale celulelor mamiferelor, iar unele proteine ale mamiferelor active biologic pot fi exprimate prin urmare cu succes i secretate de Saccharomyces cerevisiae. n plus, transformarea Saccharomyces cerevisiae cu ADN strin i binescunocuta tehnologie de fermentare a acestui organism, face din Saccharomyces cerevisiae o gazd bun pentru producerea de proteine heteroloage. Cu toate acestea, Saccharomyces cerevisiae prezint unele dezavantaje, cnd este folosit pentru producerea unor anumite proteine recombinante heterogene. Astfel de probleme au fost observate ca rezultat al instabilitii plasmidiale ducnd la hiperglicozilarea proteinelor heterogene secretate, ceea ce poate cauza efecte de imunogenitate nedorite. Pentru a depi astfel de modulri nedorite ale proteinelor recombinante de interes, au fost investigate tulpini alternative, pentru a fi folosite ca organisme gazd [[29], [30]]. Celulele haploide de mperechere de tip ? ale Saccharomyces cerevisiae, secret feromonul factor - ?, printr-o combinare eficient a celulelor haploide a i ?. Factorul - ? al Saccharomyces cerevisiae prepro ? leader este cel mai folosit ca sistem de exprimare secretorie pentru proteinele heterogene n numeroase i diferite tulpini, incluznd i Saccharomyces cerevisiae. Fuziunea ntre secvena prepro ? leader cu o gen heterogen, permite ca Saccharomyces cerevisiae s secrete proteine heterogene, deoarece secvena leader mediaz translocarea cotranslaional (Figura 10) a fuziunii proteinei n eucariote [31]. Preregiunea secvenei leader este separat de o peptidaz ? semnal, iar n aparatul Golgi endoproteaza Kex2 separ preregiune n partea C-terminal a maturrii dibazice Kex2. nainte de secreie, peptida spaiatoare a maturrii Kex2 de la extremitatea C-terminal este nlturat prin aciunea dipeptidil ? aminopeptidazei, codificat de gena STE13 i proteina heterogen este eliberat n mediul extracelular [32]. De-a lungul timpului au fost efectuate studii pentru a mbunti secreia de insulin prin folosirea factorului ? prepro ? leader al Saccharomyces cerevisiae; ntregul ? - factor prepro ? leader al Saccharomyces cerevisiae a fost folosit pentru studiile iniiale n secreia de insulin cu o peptid spaiatoare avnd o secven Glu ? Ala ? Glu ? Ala, care rezult prin fuziunea proteinelor artate n Figura 10 [33]. Figura 10. Ilustrarea unui ? factor prepro-leader fuzionat cu un precursor al insulinei. n acest studiu, peptida spaiatoare a fost ndeprtat cu greu de dipeptidil ? aminopeptidaza, obinndu-se n principal un precursor al insulinei Glu ? Ala ? Glu ? Ala, deci spaiatorul a fost ndeprtat prin mutageneza direct asupra locului. Aceast modificare a factorului ? al secvenei leader a relevat cu succes exprimarea i secreia a numeroi precursori insulinici. Alte studii au artat avantajul unui spaiator, deoarece poate fi atins o mbuntire a procesrii Kex2p, ceea ce n cazul insulinei este de preferat deoarece procesarea insuficient a Kex2, poate cauza o hiperglicozilare i o depreciere a produciei de insulin. Cnd spaiatorii potrivii i creai n aa fel nct s poat fi ndeprtai de tripsin sau de Achromobacter lyticusce cu o proteaz specific Lys1, au fost introdui ntre Kex2 dibazic i precursorul insulinic, producia de precursor al insulinei a fost mbuntit. Prezena unui spaiator nu numai c s-a dovedit a fi un succes pentru secreia secvenei leader a factorului ? fuzionat cu precursorul insulinei, dar i glicozilaza N ? lincat a celor dou pri a ?-factorului propeptidglicozilat, localizate aproape de precursorul insulinei, joac un rol de pivot n procesul de secreie, deoarece lipsa acestor dou glicozilaze micoreaz semnificativ secreia precursorului insulinei [34]. O alt exprimare a fost recent demonstrat la Saccharomyces cerevisiae sub designul secvenelor prepro ? leader obinute prin combinarea unei abordri raionale i a unei optimizri treptate [35]. Dac liderii sintetici au fost folosii ntr-un context spaiator potrivit, producia de precursor de insulin a depit producia obinut cu ? - factori prepro ? leaderi, i mai departe liderii sintetici au facilitat secreia nu numai a insulinei, dar i a altor proteine heterogene [36]. Experimentele pulsatorii au artat un timp de transmisie prelungit al liderului sintetic al proteinei de fuzionare a precursorului insulinei la Eucariote cu fuziunea proteinelor ce conin ? - factor prepro ? leader, fapt ce ofer o extindere a timpului pentru mpachetarea corect a precursorului insulinei i deci producie mrit. Cnd prepro ? leaderii sintetici lipsesc din glicozilaza N ? lincat, prile fuzioneaz cu proteina precursoare a insulinei obinndu-se o producie mai mare a precursorului de insulin mpachetat corect n comparaie cu cea obinut datorit secvenelor leader cu ? - factori. Totui, lipsa de legturi N ? glicozilate ale prepro ? leaderilor, nu a avut un impact asupra capacitii de secreie, ceea ce contrasteaz cu ceea ce a fost pentru prepro ? leaderii ? - factori, dup cum s-a menionat mai sus [37]. nlocuirea prii de maturare Kex2, cu o alt parte procesat enzimatic, aparinnd prepro ? leaderilor cu legturile N ? glicozilaz lips, a dus la o secreie a precursorului insulinei neprocesat, iar acest precursor neprocesat ar putea fi purificat din mediul de cultur i maturat in vitro prin adugarea de lysyl ? proteaz specific produs de Achromobacter lyticus [38]. nlocuirea situsului de maturare Kex2 cu un alt situs proteolitic poate fi potrivit pentru secretarea de proteine heterogene, ce au secvena de maturare Kex2 n structura lor, deoarece o anume protein poate fi scindat de endoproteaza Kex2, ceea ce cauzeaz o descretere a produciei de proteine heterogene. Deci, prin alegerea unei enzime proteolitice a crei secven de procesare nu este prezent n proteina heterogen de interes, aceast protein poate fi secretat ca o protein de fuziune neprelucrat ntr-o tulpin mutant kex2 i treptat maturarea se poate induce in vitro. n continuare, secreia unei proteine heterogene neprelucrate ce are un pro ? leader sintetic poate fi comparat avantajos cu secreia unei proteine heterogene prelucrate, deoarece acest pro ? leader induce o stabilitate i o solubilitate a proteinei de fuziune, ceea ce este de preferat nainte de nceperea purificrii i maturrii proteinei de fuziune. Noua descoperire a secvenei sintetice prepro ? leader s-a demonstrat a fi o prghie extrem de puternic pentru exprimarea i secreia de insulin, iar aceste secvene leader pot activa exprimarea i secreia proteinelor heterogene, ceea ce nu este posibil cu factorul ? - prepro ? leader folosit n mod tradiional. Conceptele descrise mai sus relateaz cteva exemple de obinere de tulpini de Saccharomyces cerevisiae cu propieti noi sau mbuntite prin inginerie genetic i metabolic. Ideea de baz n utilizrile tulpinilor de Saccharomyces cerevisiae este aceea de a satisface din ce n ce mai multe scopuri biotehnologice. Deoarece secvena complet genomic a drojdiei este cunoscut, schimbrile genetice int sunt mai uor de obinut prin tehnologia ADN recombinant, ceea ce faciliteaz i accelereaz studiile de inginerie metabolic.. Totui, rigiditatea Saccharomyces cerevisiae privind alterarea funciilor ei metabolice poate limita anumite abordri ale metabolismului ingineresc, acest microorganism are cu siguran un potenial mrit pentru cile energetice. Un numr de noi aplicaii bazate pe Saccharomyces cerevisiae vor aprea n viitor, iar acestea, mpreun cu exemplele menionate, vor ilustra clar potenialul tulpinii Saccharomyces cerevisiae, ca fabric celular n procesele biotehnologice.________________________________________[1] Lindquist, G., Molecular Psychiatry, 1, 376-379, (1996).[2] Bailey, J. E., Science, 252, 1668-1675, (1991).[3] Stephanopoulos, G., Aristodon, A., Nielsen, J., Metabolic engineering, academic Press, Inc. San Diego, Calif., (1998).[4] Bailey, J. E., Science, 252, 1668-1675, (1991).[5] Christensen, B., Nielsen, J., Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 66, 209-231, (1999).[6] Pedersen, H., Carlsen, M., Nielsen, J., Appl. Environ. Microbiol., 65, 11-19, (1999).[7] Lindquist, G., Molecular Psychiatry, 1, 376-379, (1996).[8] Ostergaard, G., Olsson, L., Nielsen, J., Microbiol. Molec. Biol., 64, 34-50, (2000).[9] Yamano, S., Tomizuka, K., Gone, M., Imura, T., Tanaka, J, Inone, T., J. Biotechnol., 39, 20-26, (1995).[10] Erikson, P., Andre, L., Ansell, R., Blamberg, A., Adler, L., Mol. Microbiol., 17, 95-107, (1995).[11] Valadi, H., Larsson, C., Gustafsson, L., Appl. Microbiol. Biotechnol, 50, 434-438, (1998).[12] Ostergaard, G., Olsson, L., Nielsen, J., Microbiol. Molec. Biol., 64, 34-50, (2000).[13] Jensen, P. R., Snoep, J. L., Westerhoff, H. V., PCT International publication no WO 98/10089, (1998).[14] Stratford, M., A dv. Microb. Physiol., 33, 1-71, (1992).[15] Teunissen, A., Van der Berg, J. A., Steensma, H. Y., yeast, 11, 1001-1013, (1995).[16] Teunissen, A., Van der Berg, J. A., Steensma, H. Y., yeast, 11, 1001-1013, (1995).[17] Teunissen, A., Van der Berg Steensma, H. Y., Yeast, 11, 435-446, (1995).[18] Olsen, O., Thomsen, K.,K., Carlberg Res. Commun 54, 29-39, (1989).[19] Hu, Z., Nehlin, J. O., Ronne, H., Michels, C. A., Curr. Genet., 28, 258-266, (1995).[20] Trumbly, R. J., Mol. Microbiol., 6, 15-21, (1992).[21] Lutfiyya, L. L., Jonston, M., Mol.Cell.Biol., 16, 4790-4797, (1996).[22] Klein, C. J. L., Rasmunsen, J. J., Ronnow, B., Olsson, L., Nielsen, J., J. Biotechnol., 68, 197-212, (1999).[23] Klein, C. J. L., Olsson, L. L., Nielsen, J., Enzyme Microb. Technol., 23, 91-100, (1998).[24] Klein, C. J. L., Olsson, L., Ronnow, B., Mikkelsen, D. J., Nielsen, J., Food Technol. Biotechnol., 35, 287-292, (1997).[25] Ostergaard, G., Olsson, L., Nielsen, J., Microbiol. Molec. Biol., 64, 34-50, (2000).[26] Hitzeman, R. A., Hagie, F. E., Levine, H. L., Nature, 293, 717-722, (1981).[27] Velenzuela, P., Medina A., Rutter, W., J., Ammerrer, G., Hall, D., Nature, 298, 347-350, (1982).[28] Schekman, R., Novick, P., The molecular biology of the yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor N.Y., 361-393, (1982).[29] Buckholz, R. G., Gleeson, M. A. S., Appl. Biochem. Biotechnol.,38, 105-140, (1991).[30] Romanos, M. A., Scorer, C. A., Clare, J. J., Yeast, 8, 423-488, (1992).[31] Brake, A. I., Yeast Genetic Engineering, P. J. Barr, A. J. Brake and P. Valenzuela, Butterwarths, Boston, 269-280, (1989).[32] Zsebo, K. M., Lu, S., Fieschko, J. C., Goldstein I., J. Biol. Chem., 261, 5858-5865, (1987).[33] Thim, L., Hansen, M. T., Norris, K., Boel, E., Proc. Nat. Acad., Sci USA 83, 6766-6778, (1986).[34] Corplan, S., Green, R., Rocco, J., Kurjan, J., J. Bacteriol, 173, 627-635, (1991).[35] Kjeldsen, T., Petterson, A. F., Hach, M., Diers, I., Hansen, P. M., Andersen, A. S., Protein Expr. Purif, 9, 331-336, (1997).[36] Kjeldsen, T., Petterson, A. F., Hach, M., Diers, I., Hansen, P. M., Andersen, A. S., Protein Expr. Purif, 9, 331-336, (1997).[37] Kjeldsen, T., Hach, M., Petterson, A. F., Markussen, J., Protein Expr. Purif., 14, 309-316, (1998).[38] Kjeldsen, T., Hach, M., Petterson, A. F., Markussen, J., Protein Expr. Purif., 14, 309-316, (1998).