Referat medicina. METODA RADIOIMUNOLOGICA

METODA RADIOIMUNOLOGICACuprins:1. Introducere2. Principiul Metodei RIA3. Radioizotopul4. Metode derivate din principiul metodei radioimunologice5. Aplicatii medicale6. BibliografieMETODA RADIOIMUNOLOGICAIntroducerePentru omul primitiv cerul era minunat,misterios si nemaipomenit,dar el nici nu visa la ceea ce era dincolo de discul de aur sau de punctele argintii de lumina,atat de departe de cat putea el sa ajunga..Telescopul,spectroscopul,radiotelescopul toate uneltele si chichitele stiintei moderne au folosit ca ca dovezi detaliate omului in incercarea lui de a descoperi,de a analiza si de a putea intelege mai bine componentele interioare si structura fina a acestor corpuri ceresti.Omul insusi e un obiect misterios si instrumentele ce ii pot testa natura sa fiziologica si functionala au evoluat treptat de-a lungul mileniului.Becquerel,sotii Curie si Joliot Curie cu descoperirile lor in radioactivitatea naturala si artificiala si Hevesey,un pionier al aplicatiilor izotopilor radioactivi in studiul proceselor chimice ,au fost acei oameni de stiinta cu un rol deosebit de important in cariera mea.In ultimii 30 de ani m-am dedicat dezvoltarii si aplicarii metodei izotopilor radioactivi in cercetarea structurii deosebite a sistemului bologic.Din 1950 si pana la moartea sa premature in 1972 Dr.Solomon Berson mi-a fost alaturi in aceasta aventura stiintifica si impreuna am dat nastere si am ocrotit inca de la inceput imunitatea radioactive,o unealta puternica in determinarea oricarei substante de interes biologic ,fie ea si ipotetica.Ce bine ar fi sa fie si el aici sa impartasim acest moment.Radioimunoanaliza se bazeaza pe reactia reversibila imunochimica dintre antigen(Ag) si anticorp(Ac) din care rezulta un complex solubil Ag-Ac(complex imun).Cuplarea Ag-Ac este o reactie cu o inalta specificitate,deoarece un anumit Ac nu poate lega decat Ag fata de care a fost sintetizat.Complexul imun este stabilizat prin forte de distente scurte:legaturi de hidrogen,legaturi ionice,legaturi Van der Waals.Metoda radioimunologica este denumita o metoda prin competitie deoarece la reactie participa:molecule de Ac,molecule de Ag,molecule de Ag marcat cu un izotop radioactiv.Radioizotopul cel mai utilizat pentru marcarea moleculelor de antigen este 125 I,un emitator de tip .Deoarece antigenii sunt molecule organice ei se mai pot marca si cu 14 C SAU 3H care sunt emitatori de tip si care necesita deci detectori de scintilatie speciali. (1.a)Metoda radioimunologica a luat fiinta nu ca un produs direct ci mai mult ca o concluzie a cercetarilor noastre,o cercetare ce ar putea fi considerata un studiu nerelevant.Dr.I Arthur Mirsky a pornit de la ipoteza ca maturitatea accelerata a diabeticilor nu ar fi o cauza a secretiei de insulina ci mai mult o degradare rapida si anormala a insulinei secretata de glanda hepatica (1).Pentru a proba aceasta ipoteza , am studiat metabolismul insulinei artificiale administrata intravenos subiectilor diabetici si non-diabetici.Am observat ca insulina radioactiva disparea mai incet din plasma pacientilor ce mai primisera insulina pana atunci ,fie ca tratament pentru diabet sau ca terapie prin socuri pentru schizofrenie decat din plasma acelora care nu au mai fost tratati cu insulina anterior .Am presupus ca rata scazuta a disparitiei insulinei se datora interactiunii insulinei artificiale cu anticorpii ce se dezvolta ca raspuns la administrarea exagerata de insulina.Totusi tehnicile imunologice clasice nu erau adecvate in detectarea anticorpilor pe care noi iicredeam a fi intr-o concentratie atat de mica incat nu puteau fi luati in considerare .Asadar am introdus metode radio-izotopice de o sensibilitate ridicata in detectarea tipurilor solubile a complecsilor de anticorpi.Sunt modelele electroforice ale insulinei artificiale in plasma de control si a pacientilor tratati cu insulina.In cazul pacientilor tratati cu insulina,insulina artificiala se uneste si migreaza cu o inter beta-gamma globulina.Utilizand o varietate de asemenea sisteme am putut demonstra marea raspandire a insulinei ce se uneste cu anticorpii in cazul subiectilor tratati cu insulina.Acest concept nu a fost acceptat de imunologi la mijlocul anilor 50.Lucrarea originala ce descrie aceste descoperiri a fost respinsa de stiinta si initial de Jurnalul de Investigare Clinica .Un compromis cu editorii a dus in final la acceptarea lucrarii,dar numai dupa ce am omis termenul anticorpi insulinadin titlu si am documentat cocluzia cum ca globulina mixta era intr-adevar un anticorp prin faptul ca se potrivea definitiei anticorpului dintr-un manual standard de bacteorologie si imunologie.Prin faptul ca am utilizat tehnici radio-izotopice in studiul reactiilor primare a antigenului cu anticorpii si prin analiza complecsilor solubili am initiat o revolutie in imunologia teoretica in ceea ce astazi considera ca peptidele mici cat capilarele si oxitocinele sunt antigene pentru unele specii si ca echilibrul constant intre antigeni si anticorpi poate fi la fel de mare ca 10 14 litri pet molecula,o valoare de aproape 10 ori mai mare decat cea mai ridicata valoare prevazuta de teoria lui Paulings in 1940(2).In aceasta lucrare am mentionat de asemenea ca uniunea dintre insulina artificiala si o concentratie fixa de anticorpi este o functie cantitativa a aportului de insulina deja existente .Aceasta observatie a stat la baza metodei radioimunologice a insulinei din plasma.Totusi investigatiile si analizele ce au durat cativa ani si care au inclus studii ale aspectelor cantitative a reactiei dintre insulina si anticorpi si a speciilor specifice biotopului disponibil au fost cerute pentru a traduce conceptele teoretice ale metodei radioimunologice in experimente ce au dus mai intai la masurarea insulinei din plasma la iepuri in urma administrarii excesive de insulina si in final in 1959 la masurarea insulinei in plasma umana(3).RIA este in principiu,simpla .Concentratia a antigenului natural,necunoscut este obtinuta prin compararea efectului inhibitor al uniunii antigenului artificial radioactiv cu anticorpi specifici cu efectul standardelor necunoscute .Sensibilitatea RIA este remarcabila .La fel de putin ca amestecul de incubare de 0,1 pg.gastric/ml i.e,0,05 picomolar gastrin ,este totusi masurabil.RIA nu este o tehnica de diluare a izotopului ,cu care fusese confundata ,de altfel,intrucat nu este necesar un comportament biologic sau imunologic indentic al antigenului artificial sau natural.Validitatea RIA depinde de comportamentul imunologic identic dintre mostre necunoscute de antigen cu antigenul la standardele cunoscute.Specificul reactiilor imunologice permite deferentieri imediate,de exemplu,intre corticosteron si cortisol,steroizi ce difera doar prin prezenta sau absenta unei singure grupari hidroxil.Nu este necesar ca mostrele standard sau cele necunoscute sa fie identice din punct de vedere chimic sau sa aiba comportament biologic identic .Mai mult chiar,s-a demostrat ca cel putin unele teste pot fi utile clinic,desi ele nu pot fi calidate corespunzator din cauza lipsei indentitatii imunologice dintre mostrele standard si cele ale caror concentratie trebuie determinata.Principiul Metodei RIAPrincipiul RIA nu se limiteaza doar la sistemul imunitar ci poate fi extins si pentru alte sisteme in care an locul anticorpului specific este un anumit reactor sau substanta de legatura.Aceata poate fi o proteina anume din componenta plasmei,o enzima specifica sau o pozitionare a unui receptor al tesutului .Herbert si asociatii au demonstrat mai intai aplicabilitatea diferentei radiologice de masurare continutului de vitamina B12 intr-un receptor al ficatului utilizand co-vitamina B12 si a factorului intrinsec ca si substanta de legatura.Totusi,i-a ramas lui Rothenberg , in laboratorul nostru si lui Ekins sa efectueze teste pentru serul vitaminei B12 utilizand acest peincipiu.Ekins si mai tarziu Murphy au utilizat tiroxina in reactie cu globulina ca reactor specific pentru masurarea serului de toroxina.Nu este necesar ca un atom radiactiv sa fie "acel ceva care trebuie sa eticheteze antigenul sau substanta de legatura a reactorului.In ultima vreme accentul a cazut,cu precadere,pe utilizarea enzimelor ce sunt covalent legate de antigen.Desi multe variatii ale diferentelor dintre teste au fost sesizate ,RIA a ramas metoda aleasa si este posibil sa ramana asa cel putin in testele unde este nevoie de sensbilitate mare.Testele pentru localizarea receptorului de hormoni peptidici au avantajul sau cel putin asa se crede de a fi masurata activitatea biologica dar sunt ,in general,de la 10 la 100 de ori mai putin sensibilitate decat RIA.Testele pentru depistarea enzimelor au cateva dezavantaje,cel mai important este acela ca obstacolul steric introdus intre reactia antigenului cu anticorpul datorita prezentei moleculelor de enzime duce ,aproape inevitabil, la scaderea sensibilitatii testului.Acum 20 de ani cnd procedurile de testare biologica erau la inceput,prima prezentare asupra potentialului de masurare a hormonilor prin testari imuno-radioactive(3)abia daca a fost luata in considerare.Cumva mai mult interes a generat demonstratia din 1959 a aplicatiilor practice ale testelor imuno-radioactive in masurarea nivelului de insulina din sange la om(9).A devenit evident ca simplitatea si sensibilitatea testelor imuno-radioactive au permis testarea sutelor de mostre de sange,fiecare la fel de mica ca si o fractiune de milimetru ,lucru ce a facut posibila masurarea nu numai a unei singure mostre sa sange,asa cum fusese practicata ocazional in testarile biologice pe viu,dar a mai multor mostre ,fapt ce a facut posibil studiul propriu zis si aleatoriu in circulatia nevelului de insulina ca raspuns la stimuli psihologici(2).Nu in ultimul rand ,la inceputul anilor 60 rata cresterii testarilor imino-radioactive era oarecum lenta.Doar in lucrari ocazionale,inafara de cele efectuate in laboratorul nostru,au fost mentionate aceste lucruri,in lucrari ale jurnalelor americane de endocrinologiesi diabet de dinainte de 1965. La sfarsitul anilor 60 RIA devenise o unealta importanta tn laboratoarele de endocrinologie iar in ultima vreme s-a extins dincolo de cerecetarea din laborator a medicinei nucleare ,si a laboratoarelor clinice.S-a estimat ca in 1975 numai in SUA,peste 4000 de spitale si laboratoare clinice au efectuat teste imuno-radioactive de tot felul,un numar aproape dublu fata de un an sau doi mai devreme iar rata acestei cresteri para sa nu se fi diminuat in ultimii doi ani .Simplitatea din punct de vedere tehnic a RIA si usurinta cu care reactivii pot fi obtinuti a facut posibila uzul extins al acestei metode chiar si in tarile mai putin dezvoltate din punct de vedere stiintific.Cresterea exploziva a RIA a generat din aplicabilitatea,la modul general din cadrul diverselor domenii de investigare biomedicala si diagnostic medical.O listare evidenta dar totusi incompleta a substantelor masurate cu RIA este data la .Sensibilitatea nemaipomenita,specificitatea si usurinta in comparare a RIA,mai ales acum ca instrumentele si reactivii sunt usor de gasit,au permis testarea biologica a unor materiale importante,materiale ce pana acum era imposibil sau extrem de dificil de analizat.Numai prin descoperire si analiza putem intelege cu adevarat,in aceasta constand de fapt marea contributie a RIA la analiza mai profunda a functiilor si perturbarilor structurii sistemului biologic.In prima decada ce a urmat de la RIA si primele sala aplicatiiin masurarea nivelului de insulina din sange la om,primele merite au fost recunoscute in domeniul endocrinologiei. Posibilitatea de a masura in prezenta unei concentratii foarte mari a proteinelor din sange (concentratia minima de 10 la 10M a hormonilor peptidici cu o specificitate ridicata a reactiilor imunologice)a furnizat o mare crestere a preciziei de diagnosticare a starilor patologice caracterizate de o deficienta sau de un exces hormonal.Ipotetic,s-au descoperit toate datele acum stiute despre reglarea secretiilor hormonale,fapt ce a contribuit cu mult la intelegerea mecanismelor de eliberare a hormonilor si de psihologia hormonala in general.Recent asacum vor discuta probabil si Dr.Guillemin si Schally,au fost efectuate investigatii cu privire la rolul potential al secretiei hipotalamusului si a urmarilor acestor secretii si studii ce au fost mai usoare de efectuat datorita RIA atat prin controlul asupra hormonilor cat si asupra factorilor propriu-zisi .In ultimii ani RIA a avut un rol important in descoperirea unor noi hormoni in sange si in tesut.Acestea includ si tipuri mari de hormoni proinsulina,acidul gastric,hormonul poroparatiroidian,marele ACTH etc si fragmente mai mici printre care si fragmentul hormonului proparatiroidian cu terminatia COOH ,inactiv din punct de vedere biologic(5).Aceste studii au generat noi interese in ceea ce priveste biosinteza hormonilor peptidici.Sa luam acum in considerare cateva exemple din laborator dintre cele mai vechi dar si mai noi aplicatii ale RIA.Interpretarea corecta a nivelului de hormoni din sange in diagnosticele clinice cere o buna intelegere a factorilor implicati in reglarea secretiei hormonale.In general aceasta secretie este stimulata de "destinatia hormonului rezultat in starea biologica de "homeostaza.Un sistem reprezentativ in ceea ce priveste acest subiect esta aratat in. Reglarea este efectuata de-a lungul procesului de feed-back,ciclu ce are la un capat hormonul iar la celalalt substanta ce reglaza si care la randul ei este reglata.Secretiile gastrice cresc aciditatea grastica care duce la sistarea secretiei initiale.Modelarea acestui sistem poate fi afectata de anumiti factori printre care cel mai important este probabil hranirea.Prin hranire sec declanseaza automat secretia gastrica prin intermediul reactiei chimice la nivelul celulelor receptoare si indirect prin dilatarea gastrica si efectul de tamponare al mncarii.Sunt comparate concentratiile gastrice de baza la pacienti cu anemie fatala(P.A),la pacienti cu sindromul Yollinger-Ellison(ZE) si la un grup de pacienti diagnosticati cu hipergastrita hiperclorhidrica benigna(NT-HH).Nivelul gastric este in general destul de ridicat in oricare din cele trei tipuri de pacienti intrucat limita superioara la subiectii normali este de 0,1ng/ml.Totusi cauzele sunt diferite.Pacientii cu P.A au hipoaciditate gastrica.Din moment ce acidul hidrocloric sisteaza in mod normal secretia gastrica,absenta continua a acidului si stimularea repetata a hranirii produce an cele din urma,ca efect secundar,o hipersecretie a celulelor gastrice. Nivelul foarte ridicat al lichidului gastric in P,A este relativ potrivita in absenta efectului inhibitor al acidului clorhidric in secretia gastrica.Nivelele mai ridicate in ZE si NT-HH sunt nepotrivite din moment ce pacientii sufera de hiperaciditate si mecanismul de feed-back ce ar trebui sa sisteze secretia gastrica a dat gres.Cum poate o singura deosebire dintre pacienti cu secretie gastrica cancerigena(YE)si cei a caror secretie gastrica anormala sa fie cauza unei supraactivitati a celulelor gastrice secretoare a intestinului gastric.Diagnosticele potrivite in aceste cazuri sunt esentiale deaorece procedurile adecvate tratamentului sunt atat de diferite iar un diagnostic gresit ar putea fi fatal.Unii pacienti YE au nivelul mai ridicat dect in cazul celor cu boala necancerigena.Totusi in aceasta zona de depasire a diferentei dintre cele 2 boli se ajunge imediat la baza acestei pasivitati in fata diferitilor stimuli.Pacienti cu YE raspund la o provocare a calciului(2mgCa/kg intravenos) sau la o provocare a secretiei provocate cu o crestere dramatica in lichidul gastric dar care da gres cand vine vorba de un test al mancarii,pentru pacienti cu NT-HH metoda inversa este valabila. Asadar in aplicatiile RIA in probleme de hiper sau hiposecretie nu ar trebui sa nu bazam pe o singura determinare a lichidului hormonal .In general pentru a testa starile de deficienta,concentratia lichidului hormonal ar trebui masurata nu numai in stareainitila ci si dupa administrarea unor stmuli psihologici sau medicali corespunzatori.Cand este banuita hipersecretia si totodata concentratiile ridicate de hormoni trebuie determinat daca nivelul este corespunzator sau nu si daca secretia hormonala este autonoma sau poate fi modificata de agenti psihologici sau farmacologici specifici.Asemenea experimente sunt destul de comune astazi in endocrinologie si nu ar fi fost posibile fara RIA.In decursul ultimei decade conceptiile noastre despre natura chimica a hormonilor peptidici si modurile lor de sinteza s-au schimbat dramatic.Aceasta schimbare se datoreaza pe de o parte observarii bazate pe RIA ,care ne-a demonstrat ca multi ,daca nu,toti hormonii peptidici se gasesc in mai multe forme in lichidul hormonal si cel glandular dacat in oricare extras de tesut.Aceste forme pot sau nu sa fi fost active biologic si multi dintre ei reprezinta ori ori precursori ai metabolismului ori produsul bine cunoscutului,caracterizatului hormon activ din punct de vedere biologic.Existenta lor a introdus nesiguranta complicatii an ceea ce priveste interpretatrea concentratiei hormonale masurata cu RIA ,dar si cu alte teste biologice,de asemenea .Un exemplu elocvent in aceste domeniu este mai noi,interesul in heterogenitatea gastrica.Experimente constand intr-o posibila heterogenitate au fost stimulate din considerente ale endocrinologiei comparate si anume asupra heterogenitatii. Imuno-chimice a hormonului paratiroidicsi asupra unui derivat al insulinei,proinsulina.Aceste experimente au grabit descoperirea unor forme heterogene gastrice de indata ce testele imuno-radioactive in domeniu au atins acel nivel de eficienta pentru a permite fractionarea plasmei intr-o varietate de sisteme fizico-chimice si testarea lor prin intermediul imuno-radioactivitatii.Cateva metode analitice au fost utilizate pentru a elucida natura plasmei gastrice.In mod neasteptat s-a descoperit ca o componenta majora a imunoreactivitatii gastrice in starea avansata a pacientilor ce sufereau de hiperaciditate gastrica era cu mult diferita de heptadecapeptida gastrica(HG) un aminoacid peptidic ce fusese initial purificat si sintetizat de George si Tracy (6).Nou descoperita peptida oscila intre insulina si proinsulina rin filtrarea cu gel.Sephadex G50,in contrast cu HG care tindea mai mult spre insulina.Aceasta peptida avea o mobilitate electroforica in gelul de amidon mult mai mare decat serul de albumina,care este cam jumatate cat mobilitatea HG-ului.Experimente in alte sisteme fizico-chimice au ajuntat la verificarea acestei peptide ca fiind intradevar mai mare si mai importanta decat HG.Datorita acestei trasaturi am numit acea forma marele gastric (BG).Amandoua forme au fost gasite intr-o mostra de tesut bolnav al unui pacient ce ZE cat si in mostre de pe peretii si din apropierea intestinului subtire(4).Mai mult, am demonstrat ca HG poate fi generat de o digestie treptata a BG cu nici o schimbare importanta in ceea ce priveste imunitatea radioactiva.Am presupus ca forma mai mare era compusa din cea mica avand ca terminatii finale grupari amino legate de reziduuri ale unor alte peptide.Presupunerile noastre aveau la baza masuratori ale unui picogram cu canitati reduse(nanogram) de acid gastric imuno-reactiv in prezenta unei concentratii foarte mari de alte proteine i-au facut pe George si Tracy sa purifice si sa analizeze chimic acest material.Putin dupa aceea au reusit sa izoleze atat in cazul tumorilor ZE cat si in extrase intestinale de la porci grasi perechi de peptide gastrice cu un comportament fizico-chimic similar cu cel descris pentru BG .Au demonstrat apoi ca BG este un amino-acid peptidic cu doua reziduuri de lisina adiacente terminalului N al reziduului de HG.Spre deosebire de proinsulina care ipotetic este lipsita de orice activitate biologica,administrarea pe viu la un caine a unor cantitati identice de BG si HG au avut acelasi rezultat.Totusi timpul de reactie la BG este de la 3 la 5 ori mai lung decat la HG .Astfel,dupa o administrare repetata a acelorasi doze nivelul lichidului BG este de 3 pana la 5 ori mai mare decat HG.Este evident ca heterogenitatea aduce complicatii testelor biologice la fel ca si in cazul celor imunologice,din moment ce activitatea biologica definita in functie de clasica metoda doza-reactie in mod cert difera de cea definita in functie de concentratia lichidului si tipul efectului in cazul gastritei sau a oricaruitip de activitate biologica legata de peptide cu timpi de reactie deferiti.Descopeirea noastra in cadrul heterogenitatii imuno-chimice a hormonului paratiroidicsi descoperirea proinsulinei de Steiner cu o decada in urma au initiat o revolutie in conceptul de biosinteza a hormonilor peptidici.Sugestia initiala ca o mare utilitate a proinsulinei in biosinteza este aceea de a facilita unirea gruparilor disulfit nu a putut prevedea ca ipotetic toate peptidele ,inclusiv cele ce constau intr-un simplu lant liniar,par sa aiba si ele numerosi derivati.In majoritatea cazurilor ,dar nu in toate,hormonii peptidici sunt legati intr-o forma mai complexa de reziduuri de baza (insulina,gastrina etc).O exceptie de luat in considerare in acest caz este colecistochinina (CCK).In cazul CCK si terminatia sa de COOH-octapeptida(CCK-8),ambele active bilogic,separarea formei mai mici are loc la partea terminala COOH printr-un singur reziduu de arginina(7).Dupa cum urmeaza ambele forme de gasesc in tesuturi de baza.In prezent,dupa o decada de la dezvoltarea conceptului de heterogenitate si in ciuda cantitatii enorme de date in domeniu,tot nu stim prea mult de regulile sau motvele acestui produs sintetic.Este sinteza hormonilor peptidici,intr-o forma in care se leaga de o alta peptida de baza ,doar pentru depozitarea sau eliberarea ei adecvata .In ce sunt implicate enzimele in procesul de conversie Sunt aceste enzime convertoare hormoni specifici sau specii specifice Conversia are lod doar in tesutul secretor sau mai este o conversie periferica de la forma inactiva la cea activa Gasind raspunsuri la acestea si la altele care au legatura cu ele va fi ceea ce ne va tine ocupati pentru o vreme pe multi dintre noi.De cand investigatiile cu privire la peptidele creierului precum si cu succesul pe care il are RIA pana acum este relevant ca combinam aceste doua subiecte si sa discutam aplicabilitatea RIA in intelegerea peptidelor creierului.Recent s-a aratat mult interes in faptul ca exista cateva peptide comune att creierului cat si tubului gastrointestinal.O determinare a locatiei si a concentratiei acestor peptide depind,de obicei,de tehnici imunologice.Descoperirea lui Vanderhaeghn a unei noi peptide in sistemul nervos central vertebrat ce reactioneaza cu anticorpi impotriva gastritei a fost confirmata de Dockray,care a sugerat ca peptidele creierului seamana cu colecistochinina(CCK),mai mult decat peptidele gastrice.Am extins aceste studii si am demonstrat ca peptidele din creier nu fac parte din familia gastrica sau cea a CCK-urilor ,si sunt de fapt colecistochinina intacta(CCK) si terminalele sale octa-peptidelor-COOH(CCK).Aceste observatii depind de utilizarea a doi antiseri cu proprietati imuno-chimice diferite.Unul a fost preparat intr-o capra prin imunizarea cu CCK porcin(pCCK).Pentru scopuri practice acest aniser nu reactioneaza cu CCK-8 sau cu substantele gastrice,mici sau mari,in ciuda faptului ca au in comun terminatia pentapeptidica COOH.Celalalt antiser a fost preparat prin imunizarea unui iepure cu tetrapeptido-amida gastrica cu terminatia COOH.Cu acest antiser reactiile adverse a pCCK-ului si a CCK-8 sunt ipotetic identice la scara molara.Utilizand serul K8 am observat ca la toate speciile de animale studiate continutul imunoreactiv masurat in testele CCK-8 a fost de aproximativ de 5 ori mai mare la nivelul intestinului decat la nivelul creierului .Totusi concentratiile la nivelul intestinului sau a creierului au putut fi coparate intre diferitele specii si nu s-au schimbat semnificativ sau pe parcursul digestiei.Filtrarea cu gel Sephadex si experimentul cu sistemul CCK 8 la nivelul intestinului si al creierului la porc,caine si maimuta au dezvaluit la modul general doua modele de marime comparabila ,unul cu o evolutie a volumului ce seamana cu CCK si celalalt cu o evolutie a volumului asemanatoare cu CCK-8.Un mic vrf gol in volum a carui importanta nu a fost inca estimata a fost de asemenea observata.Desi nu a fost nici o schimbare imunoreactiva ce a urmat acestei digestii prelungite s-a observat conversia completa a tuturor peptidelor imunoreactive asemanatoare CCK-8.In aceleasi mostre de la caine si maimuta in care materialul CCK era prezent in aproape aceeasi concentrtie ca si la cele de la porc nu s a putut detecta imunoreactivitatea cu antip CCK ser. Extractele de intestin si creier la porc contineau cantitasi mari molare comparabile de CCK atunci cand au fost masurate cu antiser. Esecul in detectarea CCK intact la mostrele de intestin si creiri la caine si maimuta ce au dovedit a avea acest hormon atunci cand a fost masurat cu testul CCK-8 ce au stat la baza propunerilor noastre ,sustinute de RIA si anume ca sunt mari diferente intre CCK-ul porcului si a celorlalte animale la terminatia amino la nivelul molecular.Intrucat molecula nu este implicata direct in aceasta activitate biologica ,nu este surprinzatorfaptul ca secventele amino-acizilor in aceasta regiune a moleculei .i totusi secventele de amino-acizi in CCK la animale in afara de porc nu s-au semnalat.Asa cum am presupus si noi pe baza RIA i-a impulsionat pe Gregory si Tracy sa purifice si sa analizeze chimic gastrina la porc noi sperand ca ipotezele noastre cu privire la porsiunea terminla amino la CCK vor incuraja si experimentele altora.Unde se gaseste CCK in creier Concentrsia sa este mai mare in cortexul cerebral(8).Stdiile noastre imunohestochiometrice au sugerat ca CCK-8 pare in cele din urma sa se concentreze in neuronii corticali.Faptul ca am gasit peptide ce se aseamana cu CCK si CCK-8 in sistemul nervos central a ridicat intrebari la adresa funcsiilor psihologice cu precadere asupra rolului lor de potential factor de satietate.Observatiile lui Gibbs ca o injectie cu CCK si CCK-8 pur dau senzatia de satietate desi pentagastrina si secretina nu au sugerat un feedback negativ din partea tubului gastrointestinal ca mecanism de declansare.Aceste studii ale lui Gibbs au confirmat studiile anterioare ale lui Schally care aratase ca enterogastronul un extras de intestin extrem de bogat in CCK inhibau foamea la soareci.Concluzia ca peptidele CCK se gasesc la nivelul creierului a sugerat un rol important pentru ele mai mult de neuroreglatori.Acum este de comun acord acceptat ca exista un grup de peptide ca somatostatinele substanta P,peptide intestinale vasoactive si CCK-urile si terminatiile lor octapeptidice ce se gasesc atat in tubul gastrointestinal cat si in sistemul nervos central.Au fost prezentate de asemenea unele dovezi cum ca peptidele hormonii peptidici precum lipotropina,ACTH si peptidele ce deriva din ele,initial crezute ca fiind de origine hipotalamica,s-au gasit in numar mare in zonele extrahipotalamice.Am luat in considerare si posibilitatea faptului ca am gasit un hormon de origine hipotalamica asa cum am gasit ACTH in creierul unui sobolan,ce ar putea fi o consecinta a micii dimensiuni a creierului.Astfel am inceput recent sa lucram la distributia ACTH-ului in creier,nu numai la rozatoare precum sobolani si iepuri ci si la animale cu creier mai mare precum caine,maimute si oameni(9).Am observat ca cantitatea in care se gaseste ACTH este cam aceeasi pentru toate cele 5 specii dar s-a observat zona anatomica ce contine ACTH este invers proportionala cu marimea creierului.Astfel ACTH este larg distribuit in creierul sobolanului,dar este gasit doar in zonele hipotalamice la primate. Din moment ce nu exista nici un motiv sa presupunem ca mecanismul artificial difera la animalele cu creier mic fata de primate,credem ca aceste studii arata ca hipotalamusul nu prea este locul de baza a sintezei ACTH-ului si ca hormonul este gasit in alte zone craniene datorita altor procese decat sinteza.Cunostintele noastre actuale ne fac sa credem ca este posibil ca hormonii despre care se stia ca sunt sintetizati in hipofiza,sunt sintetizati numai acolo si sunt transportati spre creier prin unul sau mai multe mecanisme,probabil prin incetinirea vaselor portale sau prin scurgerea in cisterna fundamentala.Exemplele alese provin dintr-o mostra a unor studii in endocrinologie din moment ce citatul pentru acest premiu Nobel se ocupa exclusiv cu problema RIA din acesta subspecialitate.Totusi RIA se extinde rapid dincolo de limitele endocrinologiei,locul sau de pornire.RIA a oferit deja o noua dimensiune indentificarii si masurarii substantelor active din punct de vedere farmaceutic in plasma si tesuturi si lista cu multe alte incercari.In general din moment ce concentratiile molare ale drogurilor la nivel farmaceutic sunt comparate cu cea a hormonilor hipofizi din corpurile fluide,obtinerea unei sensibilitati nu pare dificila.Totusi rolul RIA asupra drogurilor merita o catusi de putin atentie.Componente sau metaboliti inruditi din punct de vedere structural ar putea avea o imunoreactivitate relevanta cu unii antiseri dar nu cu altii care ar putea sau nu constitui o problema,dar aceasta depinde de scopul incercarii.De exemplu daca problema clinica are legatura cu toxicitatea unui anumit drog atunci intrebarea daca incercarea masoara forma activa din punct de vedere biologic sau nu esterelevanta.Daca intrebarea se refera pur si simplu la faptul daca drogul a fost sau nu luat pe furis,atunci reactivitatea metabolitilor sau variatia imunoreactivitatii cu forma exacta a drogului ar putea fi insignifianta.Folosirea RIA la masurarea enzimelor devine din ce in ce mai interesanta.Marea sensibilitate a RIA permite masurarea enzimelor la un nivel scazut,prin intermediul obisnuitelor metode catalitice.Permite analiza indeaproape a enzimelor,nu numai a efectelor si nu este influentata de elemente ce ar putea activa sistemele enzimelor sau de variatiile de substraturi.In prezenr RIA mai degraba pare sa completeze decat sa inlocuiasca metodele catalitice in ceea ce priveste analiza enzimelor.Bolul meu de cristal sau intuitia imi spune ca in anii 80 impactul RIA-ului asupra studiilor bolilor infectioase se aseamana cu cel asupra endocrinologiei din anii 60.Deja s-a facut un prim pas in virologie.Antigenulasociat cu hepatita RIA-ului a devenit o metoda eficienta de a testa sngele infectat la Crucea Rosie si alte organizatii din SUA unde hepatitatransmisa prin transfuzie a devenit o problema de sanatate publica.S-a descoperit recent ca RIA este eficient in descoperirea leucemiei analizand o cantitate mica de sange sau un extract din tesut animal.Acest fapt ne usureaza incercarea noatra de a afla unde se afla virusul de la instalarea lui si pana in etapa de maxima dezvoltare.Recent am descoperit un RIA sensibil si specific proteinelor derivate tuberculoase localizate in exteriorul sau interiorul corpului.Anticipam ca aceasta munca preliminara va spori utilizarea RIA in bacteriologie.Bolile infectioase au castigat teren provocand moartea in regiunile igienice si bine protejate.Totusi raman o problema majora si simple metode ar putea extirpa aceste boli.RIA ar putea furniza aceste metode si se observa forta pe care o emana in acest domeniu.Alte metode derivate din principiul metodei radioimunologice :O clasificare generala a metodelor de dozare derivate din principul RIA este urmatoarea(1a):Metode prin competitie : procese cu atingerea echilibrului RIA procese fara atingerea echilibrului RIA automataMetode fara competitie: procese cu atingerea echilibrului-metode imunoradiometrice procese fara atingerea echilibrului-analiza prin saturare secventialaAvantajele metodei radioimunologice sunt:deoarece reactia decurge in doua secvente succesive si nu prin atingerea echilibrului o crestere mica de antigen nemarcat va duce la o scadere mai importanta a radioactivitatii complexului imun,aceasta duce la cresterea sensibilitatii metodei.Avantajul major consta in faptul ca metoda poate fi aplicata si pentru sistemele in care afinitatile antigenului marcat si nemarcat pentru anticorp sunt diferite(1a).De remarcat ca in prezent pe langa metodele care utilizeaza radioizotopii pentru marcarea antigenului sau anticorpului exista mai multe variante in care moleculele sunt marcate cu: enzime compusi fluorescenti compusi chemiluminescentiDe asemenea plecand de la aceleasi considerente de principu reactia nu implica neaparat un antigen si anticorp specific,si se poate baza si pe interactiunea specifica dintre alte molecule.Prezentam in continuare doua exemple: domeniul care a cunoscut o dezvoltare deosebita in ultima perioada este cel al determinarii cantitative a numarului de receptori celulari dintr-un tesut,care leaga specific anumite molecule biologic active,in acest caz reactia se bazeaza pe afinitatea naturala dintre un ligand si receptorul specific(1a) in alte cazuri s-a tinut cont de faptul ca diferite elemente sau molecule sunt transportate in plasma sanguina de anumite proteine vectoare.Aceste proteine interactioneaza specific cu moleculele respective si de aceea astfel de sisteme pot fi si ele utilizate intr-o determinare cantitativa.(1a)Aplicatii medicale:Descoperirea principului RIA si al metodelor derivate a avut o importanta deosebita pentru medicina si biologie,deoarece ele se bazeaza pe reactii extrem de specifice si de aceea pot fi dozate cu precizie substante care se gasesc in cantitati foarte mici in organismele vii.Exemple de astfel de substante ar fi:hormoni hipotalamo-hipofizari(TSH,STH,ACTH)hormoni tiroidieni,insulina,proteine tumorale,proteine virale,medicamente etc(1a).In realitate lista substantelor de interes medical care pot fi dozate prin tehnici radioimunologice este cu mult mai mare.Acest lucru a fost posibil datorita unei metode prin care se pot obtine anticorpi nu numai fata de substantele capabile sa induca un raspuns imnun(proteinele)ci fata de orice alta substanta(medicamente,hormoni steroizi):in acest scop se leaga substantele pentru care dorim sa obtinem anticorpi de o proteina (haptena care va stimula un raspuns imun si apoi se separa numai acei anticorpi care interactioneaza cu regiunea ce ontine substanta de dozat(1a).Principiul acestor metode de dozare a fost extins si la determinarea numarului de receptori ai unui tesut cu ajutorul ligandului specific marcat,determinare utila nu numai in cercetarea medicali ci si investigarea clinica a activitatii unor tesuturi tumorale de exemplu(1a).Primul telescop a deschis cerul,primul microscop a deschis lumea microbilor,metodologia radioizotopica exemplificata prin RIA a probat un potential in deschiderea unor noi perspective in stiinta si medicina(10).BIBLIOGRAFIE 1.a) Valeriu Rusu,Anca Margineanu,Sorin Miron,Cipriana Stefanescu,Ion Hurjui,Irena Raileanu Lucrari practice si demonstratii de Biofizica si Fizica medicala Editura Gr.T.Popa,UMF.Iasi 20031.Day, E.D 1966.Foundations of Immunochemistry. Williams and Wilkins Co.2.Yalow,R.S and S.A Bet-son.1959 "Assay of Plasma Insulin in Human Subjects by Immunological Methods Nature 3.Berson,S.A 1957 Resume of Conference on Insulin Activity in Blood and Tissue Fluids.Editors: R.Levine and E .Anderson.National Institutes of Health,Bethesda,Maryland.4.Berson,S.A and R.S Yalow 1971 "Nature of Immunoreactive Gastrin Extracted from Tissues of Gastrointestinal Tract.Gastroenterology 5.Silverman,R and R.S Yalow 1973 "Heterogeneity of Parathyroid Hormone:Clinical and Physiologic Implications6.Gregory,R.A and H.J Tracy 1964 "The Constitution and Properties of Two Gastrins Extracted from Hog Antral Mucosa:I. The Isolation of Two Gastrins from Hog Antral Mucosa7.Jorpes J.E and V.Mutt 1973 Methods in Investigative and Diagnostic Endocrinology,Part III Non-Pituitary Hormones Editors:S.A Berson and R.S Yalow North Holland Publishing 8.Muller ,J.E, E Straus and R.S Yalow 1977 "Cholecystokinin and Ita C-terminal Octapeptide in the Pig Brain 9.Moldow,R and R.S Yalow 1978 "Extrahypophysial Distribution of Corticotropin as a Function of Brain Size "10.Valeriu Rusu Nobel, Retrospectiva 1901-1995 Laureatii premiului pentru fiziologie si medicina,Editura Omnia.