In martie 1503 Leonardo a inceput sa lucreze celebrul portret cunoscut sub numele de Gioconda sau Mona Lisa. Leonardo era foarte atasat de acest tablou, purtandu-l mereu cu sine. Pictorul si istoricul de arta Lomazzo scrie ca "Leonardo nu l-a terminat pentru ca nu stia niciodata daca nu mai avea ceva de spus... mereu se intorcea sa lucreze la el, niciodata nu i se parea ca l-a terminat". Trasaturile fine ale femeii reprezentate redau o mobilitate permanenta, o curgere neintrerupta a starilor sufletesti de o mare diversitate, cu un zambet misterios care oricand te astepti sa se accentueze, sa se atenueze sau poate chiar sa dispara. Se spune ca Leonardo, pentru a intretine in timpul lucrului fugitivul zambet al modelului, punea sa i se cante o muzica de o deosebita suavitate.
In octombrie 1503, Senioria Florentei il insarcineaza pe Leonardo sa picteze, pe peretele salii Salone dei Cinquecento al Palazzo Vecchio , "Batalia de la Anghiari"(Battaglia di Anghiari). Ea trebuia sa redea desfasurarea luptei date la 29 iunie 1441, printr-o insirare a episoadelor principale si anume, comandantul milanez cu calaretii sai inaintea bataliei, pregatirile florentinilor, apoi diferitele faze ale luptei incoronate prin victoria florentinilor.
